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我們在實驗過程中經(jīng)常遇到這樣的問題：

實驗室新買了UHPLC,想要將原來的HPLC方法轉(zhuǎn)移到新的機器上,卻不知道該怎么著手？

在文獻中查找到一個UHPLC建立的快速分析方法，如何將這個方法轉(zhuǎn)移到僅有HPLC的實驗室呢？

今天來為大家講一講，HPLC和UHPLC之間的方法轉(zhuǎn)換時應(yīng)該注意哪些問題？怎樣來選擇合適的色譜柱？

主要內(nèi)容

1. 方法轉(zhuǎn)換中的不可變條件

2. 方法轉(zhuǎn)換中的變化條件 

3. 方法轉(zhuǎn)換中的基本調(diào)整規(guī)則

1. 方法轉(zhuǎn)換中的不可變條件

在方法轉(zhuǎn)換的時候，為了達到良好的分離情況，我們應(yīng)該盡可能保持與HPLC分析方法中的主要分離條件一致。

(1) 在色譜柱中使用填料的性質(zhì)和選擇性應(yīng)當(dāng)相同。

(2) 使用的流動相組成（強洗脫有機溶劑、緩沖物組成、pH等）應(yīng)該相同。

(3) 檢測器的工作條件（檢測波長）應(yīng)該相同。

(4) 柱溫應(yīng)當(dāng)相同。

2. 方法轉(zhuǎn)換中的變化條件

方法轉(zhuǎn)換的過程中，通常是通過更換與UHPLC系統(tǒng)相匹配的，具有相同分離性能的色譜柱規(guī)格，調(diào)整流速來提高分離效率。

以下幾點是我們需要特別注意的地方。

(1) 填料的粒徑由大變小。

(2) 色譜柱的內(nèi)徑由寬變窄。

(3) 色譜柱的長度由長變短。

(4) 色譜柱的壓力降由低變高。

(5) 色譜儀系統(tǒng)的死體積和梯度滯留體積由大變小。

(6) 流動相的流速由大變小。

(7) 洗脫時間由長變短。

3. 方法轉(zhuǎn)換中的基本調(diào)整規(guī)則

現(xiàn)在，大家已經(jīng)了解 HPLC→UHPLC 方法轉(zhuǎn)換時應(yīng)該注意的可變條件和不可變條件了，那么具體怎么操作呢？

下面讓我們通過一個例子來掌握這項實用的工作技能吧。

例如，一個HPLC分析方法，使用色譜柱的規(guī)格是 4.6mm×250mm×5um；流速為1mL/min,柱壓為10Mpa,進樣體積為10uL.

那么，如果換成粒徑為2um的UHPLC柱，柱長、流速、壓力、進樣量該如何來選擇呢？

我們可以按照下面的步驟逐步來計算：

調(diào)整步驟

柱長、粒徑的選擇

流速的調(diào)整

色譜柱的壓力

進樣量的調(diào)整

（1）色譜柱規(guī)格的調(diào)整

首先引入一個分離效能的概念：

Se=L/dp

式中，L為色譜柱的柱長,mm;dp為色譜柱粒徑,um。

對于不同的色譜柱，只要能保持柱長和粒徑的比值相同，那么分離效果就是差不多的。

柱長的計算：

L2=L1×(dp2/dp1)

L2=250×(2/5)mm=100mm

根據(jù)以上計算結(jié)果，我們就可以選擇規(guī)格為2.1mm×100mm×2um的CAPCELL PAK IF2 色譜柱了。

（2）流速的調(diào)整

我們還是利用上面這個例子，現(xiàn)在規(guī)格選好了，那么流速設(shè)置多少更合適呢？

流速的計算：

式中，F(xiàn)為流速，dc為色譜柱內(nèi)徑，dp為填料的粒徑。

F2=1×(2.1/4.6)×(2.1/4.6)×(5/2)mL/min=0.52mL/min

根據(jù)以上計算結(jié)果，我們可以將流速設(shè)置為0.52mL/min.

（3）色譜柱的壓力

柱壓的計算一般使用下面的公式：

按上述計算方法，確定色譜柱規(guī)格和流速以后，在估算色譜柱的壓力時，可以僅考慮填料粒徑的影響，近似式為

式中，p為柱壓。

p2=10×(5/2)×(5/2)Mpa=62.5Mpa

CAPCELL PAK  IF2 具有超高的耐壓性能，耐壓可達100Mpa，*符合替換要求。

（4）進樣量的調(diào)整

對進樣量的計算：

式中：Vinj 為進樣量。

V2=10×(2.1/4.6)×(2.1/4.6)×(100/250)=0.83uL

在這里留個思考題：

色譜柱規(guī)格變化之后，為什么要調(diào)整進樣量呢？

您可以根據(jù)自己試驗的實際情況或檢測限的要求來調(diào)整進樣量。

這個開始看似很復(fù)雜的方法轉(zhuǎn)換問題，經(jīng)過我們一步一步地計算，是不是變得很簡單了呢？

HPLC→UHPLC的轉(zhuǎn)換結(jié)果

如果您現(xiàn)在正好有HPLC的項目，可以自己嘗試轉(zhuǎn)化成UHPLC方法，不僅可以提高分離效率，還能省下不少試劑呢！